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RNA整体解决方案

RNA
miRNA整体解决方案

miRNA简介

a. 特征与功能

miRNA是一类广泛存在于真核生物体中的长度为21-23nt的非编码单链RNA分子。成熟的miRNA能与Dicer,TRBP以及Ago2蛋白形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),该复合体进一步与特定的mRNA结合,使其降解或沉默。一个miRNA对应数百个靶基因,因此miRNA在基因表达、细胞周期、个体发育时序等方面有不可忽视的调控作用,也因此miRNA研究成为生物医药领域研究的热潮,备受科研工作者热捧!还等什么马上加入吧!


b. 作用机制

为什么miRNA有时候在转录水平,而有时候在翻译水平影响基因的表达呢?以下是miRNA的作用机制,概括起来大体分为如图A-F共6类. A:起始后机制----通过抑制翻译延长或者促使未成熟的核糖体从mRNA链上解离而抑制蛋白表达。B:翻译降解机制-----翻译过程虽未受到抑制,但正在翻译的蛋白被未知的蛋白酶降解。C-E:起始机制---这三种机制作用于翻译延长之前。不同的是C中,Ago蛋白与eIF4E竞争性与5’端帽子结构结合。D中,Ago通过招募eIF6阻止核糖体大亚基于小亚基结合。E中, Ago蛋白通过未阐明的机制阻碍mRNA链闭合。F:miRNA介导mRNA降解机制----引发mRNA链脱腺苷化以及去5’端帽子结构化, 这种机制可以同前面的机制一起发生。



Mechanisms of miRNA-Mediated Gene Silencing
(Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing. Cell. Eulalio A, et al. 2008)



miRNA研究思路

miRNA研究看似涉及领域广泛,研究方法也各有不同,但基本上遵循较为一致的研究路线,如下:



A. 表达分析——利用miRNA高通量二代测序对不同组样本进行高通量测序,不仅可以迅速找到样本间有表达差异的miRNA,而且可以发现未知的miRNA。而后利用QPCR、miRNA-FISH技术,在更多的样本或组织中,对感兴趣的miRNA的表达水平进行验证。

高通量测序检测内皮细胞与5种不同的肿瘤细胞共培养后miRNA表达的变化情况

(Tumour-secreted miR-9 promotes endothelial cell migration and angiogenesis by activating the JAK-STAT pathway. EMBO J. Zhuang G,et al. 2012)


利用原位杂交技术和QPCR在皮肤样本中检测miR-125b的表达差异

(miR-125b can enhance skin tumor initiation and promote malignant progression by repressing differentiation and prolonging cell survival. Genes Dev. Zhang L, et al.2014)


B. 靶点分析——miRNA和mRNA是通过种子区域相互作用的,所以可以基于种子序列的算法,对与某个miRNA相互作用的mRNA进行软件预测。常用的预测网站有TargetScan ,PicTar及DIANA-microT等,而后利用荧光素酶报告系统实验对预测的靶基因的作用位点进行验证。


利用TargetScan软件预测miR-21的靶基因

(MicroRNA-21 targets a network of key tumor-suppressive pathways in glioblastoma cells. Cancer Res. Papagiannakopoulos T,et al. 2008)


利用荧光素酶报告系统验证若干miRNAs和VEGFA3’-UTR作用位点

(Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNP L. EMBO J. Jafarifar F, et al. 2011)


C. miRNA功能研究


1)在细胞或者动物水平通过gain-of-function(miRNA mimics、 agomir 、慢病毒miRNA系统)、loss-of -function(miRNA inhibitor、antagomir、慢病毒miRNA spongs系统)对miRNA在细胞、疾病中的功能进行分析。通过在体外及体内的水平研究miRNA对相关细胞转移运动能力,增殖能力,分化能力,干细胞性质等方面的影响,来探索miRNA在生物进程或疾病发生和发展中的功能。


在多株肺癌细胞中,通过单克隆形成,生长曲线,细胞活力实验发现过表达mir-34a可以明显抑制癌细胞的增殖

(Development of a lung cancer therapeutic based on the tumor suppressor microRNA-34. Cancer Res. Wiggins JF, et al. 2010)


2)对已经确定的靶基因进行gain-of-function、loss-of -function实验,从靶基因的水平上验证miRNA的功能和机制,从而证实miRNA是通过影响了该靶基因从而影响了生物进程或疾病进程的发生和发展。


通过对mir-34a靶基因Tgif2的研究,证实了miR-34a是通过影响了Tgif2的表达,从而减少了血清中骨吸收标志物CTX-1, 增加骨密度,抑制骨质疏松作的发生。


( miR-34a blocks osteoporosis and bone metastasis by inhibiting osteoclastogenesis and Tgif2. Nature. Krzeszinski JY, et al. 2014)


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