图一

1、在LAC中结合表达谱综合筛选circRNA

作者进行了芯片分析，得到来自5名LAC患者的配对LAC组织和相邻非肿瘤组织中circRNA和mRNA的表达谱。在LAC肿瘤组织和配对的相邻正常组织之间总共107个circRNA（P <0.05和倍数变化> 1.5）和1691个mRNA（P <0.05和倍数变化> 2.0）差异表达。其中差异表达的circRNA有28个在LAC中上调和79个下调（图1A）。 Circos图显示circRNA的表达水平与其宿主基因的mRNA水平不相关（图1B）。为了进一步筛选候选的circRNAs，作者提取了TCGA数据库之前发表的LAC相关体细胞CNVs数据，找到50个最常见的复发变异区域（P和残余P值均<0.05），其中包括20个扩增（689个基因）和30个已删除（2160个基因）区域，将扩增区域与这些基因座内上调的circRNAs的宿主基因相互交叉，作者分别鉴定了两个扩增的宿主基因（PRKCI和P4HB）和三个缺失的宿主基因（RABL2B，FLI1，和TM4SF19）（图1C）。由于PRKCI先前已被证明是3q26.2扩增子中肺癌重要的干细胞维持者，是肺癌最常见的基因组畸变之一，因此作者假设PRKCI基因产生的circRNA（ Hsa_circ_0067934，下文称为circPRKCI）也可能在LAC中发挥重要作用，并选择circPRKCI作进一步研究。

2、circPRKCI在LAC中的特征描述

circPRKCI是由PRKCI基因（chr3：170）的两个外显子（外显子15和16）拼接。通过环状RNA的PCR验证表明，使用环状引物只能在cDNA中扩增到转录本，而线性引物在cDNA和gDNA中均扩增（图1E）。而RnaseR降解线性RNA实验表明，PRKCI的线性转录物被RNase R降解，而circPRKC1的环状转录物对RNase R处理具有抗性（图1F）。这些数据都证实了circPRKCI的存在。

图二

3、circPRKCI表达与LAC临床特征相关

使用qRT-PCR对48对原发性LAC和相邻的非肿瘤组织进行检测，发现circPRKCI高度上调，平均倍数为6.89（P <0.01）（图2A）。肿瘤大小较大的患者表现出circPRKCI的高表达（P = 0.001，图2B）。 TNM II-III期患者的circPRKCI表达高于TNM I期患者（P = 0.009，图2C）。综上所述，CirPRKCI在LAC组织中上调并与肿瘤大小和TNM分期正相关。然后使用89对LAC和相邻的非肿瘤组织的组织通过显色原位杂交（CISH）在肺癌组织中检测到circPRKCI表达，circPRKCI表达与T分期和TNM分期之间也存在正相关（图2D）。 Kaplan-Meier生存曲线显示circPRKCI水平较高的患者总生存期较短（HR = 1.977,95％CI：1.153-3.579，P = 0.037，图2E）。多变量分析表明，高circPRKCI水平是LAC患者的独立预后不良因素（HR = 2.664，95％CI：1.327-5.347，P = 0.006，图2F）。

4、PRKCI扩增与LAC中circPRKCI的上调相关

为了确定PRKCI基因扩增是否增加circPRKCI表达，作者首先检查了LAC细胞系中的PRKCI拷贝数和circPRKCI表达。与内部对照CEP3相比，作者观察到A549，SCPA1和H1299细胞中PRKCI基因的扩增（图2G）。 因此，三种细胞系中circPRKCI的表达显着高于其他细胞系中的表达（图2H）。 接下来，作者检查了60对LAC肿瘤组织中的PRKCI拷贝数变异和circPRKCI表达。与配对的非肿瘤组织相比，PRKCI拷贝数在肿瘤组织中扩增并且与circPRKCI表达正相关（R2 8 = 0.4366，P <0.01，图2I）。 这些结果表明circPRKC1的高表达至少部分归因于PRKCI基因扩增。

图三

5、circPRKCI促进体外LAC细胞系的增殖和迁移

为了研究circPRKCI的生物学功能，作者设计了两种siRNA：一种是circPRKCI siRNA（si-circPRKCI），另一种是PRKCI siRNA（si-PRKCI）。同时，也设计了circPRKC的外源过表达载体（图3A）。与阴性对照（NC）siRNA相比，circPRKCI的表达仅被si-circPRKCI下调，但不受si-PRKCI影响（图3B）。此外，与空载体（EV）相比，过表达载体显着增加circPRKCI的表达（图3C）。通过使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8），确定circPRKCI的敲低极大地损害了SPC-A1细胞的增殖能力，而外源circPRKCI的表达促进了细胞增殖（图3D，E，F）。用si-circPRKCI处理后，LAC细胞停滞于G1期（图3G），但circPRKCI敲低不影响细胞凋亡。TUNEL实验也证实circPRKCI的敲低不影响LAC细胞中的凋亡。Matrigel测定显示si-circPRKCI处理显着地损害了SPC-A1细胞的侵袭能力（图3H）。这些体外实验表明circPRKCI促进LAC细胞的增殖和迁移。

图四

6、circPRKCI可作为miR-545和miR-589的海绵

为了探索circPRKCI促进LAC肿瘤发生的分子机制，作者使用核质分离测定（图4A）和荧光原位杂交（FISH）分析（图4B）确定circPRKCI在LAC细胞系中的亚细胞定位，发现90％以上的circPRKCI存在于细胞质中。为了确定circPRKCI是否也可以作为海绵结合到miRNA并通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制来调节靶标，作者使用miRanda算法分析了circPRKCI的序列并鉴定了具有相对较高评分的五个miRNA结合位点（miR-545，miR-589，miR-600，miR-144和miR-670）。由于miRNA通常通过与Argonaute 2（Ago2）蛋白组合来沉默基因表达并形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。在ceRNA机制的背景下，Ago2可能与circRNA和miRNA结合是一种普遍现象。因此，作者进行了RNA免疫沉淀（RIP）测定以下拉结合SPC-A1和A549细胞中的Ago2的RNA转录物。结果表明内源性circPRKCI被Ago2抗体拉下（图4C）。同时，使用生物素偶联的miRNA mimic（miR-545，miR-589，miR-600，miR-144和miR-670）进行了miRNA pull-down测定，结果发现circPRKCI只能被miR-589和miR-545有效富集，而不能被其他三种miRNAs富集（图4D）。另外，RIP测定也显示miR-545和miR-589被抗-Ago2抗体有效地拉下，但不被非特异性抗-IgG抗体拉下（图4E）。此外，circPRKCI的沉默不影响miR-545或miR-589的表达，并且miR-545和miR-589 mimic的转染不影响circPRKCI的表达（图4F和G），表明circPRKCI功能为miRNA海绵，不影响miRNA的表达。这些结果表明circPRKCI根据ceRNA机制起作用，并作为miR-545和miR-589的海绵，抑制LAC细胞的肿瘤发生。

7、miR-545和miR-589降低E2F7及其下游信号的表达

为了鉴定miR-545和miR-589的潜在靶基因，通过使用TargetScan预测程序结合测序数据筛选与circPRKCI表达正相关的基因。作者鉴定了7个候选靶基因（E2F7，CENPA，DNAJC3，FRK，LRRC17，MON2和RMI2；图4H）。进一步验证发现，在沉默circPRKCI后检测到这7个候选靶基因的mRNA水平，发现只有E2F7被下调（图4I）。此外，有文献提示E2F7与肿瘤发生密切相关，因此作者推论E2F7可能是circPRKCI的下游靶点。为了验证E2F7是否是miR-545和miR-589的直接靶标，作者通过pull-down测定，发现miR-545和miR-589都能显着富集E2F7 mRNA的3'UTR（图4J）。在转染miR-545或miR-589 mimic后，E2F7的mRNA和蛋白质水平都显着降低（图4K和M）。此外，克隆E2F7 mRNA的野生型和突变体（预测miR-545和miR-589结合位点发生突变）3'-UTR，并进行双荧光素酶报告基因检测。与对照RNA组相比，miR-545和miR-589 mimic均有效地抑制野生型组的荧光素酶活性，而在突变结合位点后，抑制作用被消除（图4L）。这些结果表明，miR-545和miR-589都与E2F7的3'-UTR结合并直接下调E2F7的表达。 E2F7先前被确定为p21转录的负调节因子，随后上调下游cyclin D1以诱导细胞周期停滞。作者证实，与对照RNA相比，miR-545和miR-589 mimic上调p21，同时下调Cyclin D1（图4M）。此外，通过分析来自TCGA的RNA测序和miRNA芯片数据，发现miR-545和miR-589的表达水平与E2F7呈负相关（图4N）。这些数据表明，miR-545和miR-589都可以直接下调E2F7，从而调节其下游信号。

图五

8、circPRKCI通过circPRKCI-miR-545/589-E2F7通路促进细胞增殖

为了验证circPRKCI是否通过circPRKCI-miR-545/589-E2F7通路促进细胞增殖，作者首先证实沉默circPRKCI降低了E2F7的蛋白质水平，而过度表达circPRKCI增加了E2F7的蛋白质水平，下游p21和Cyclin D1蛋白水平也相应改变（图5A）。其次，在48例LAC患者中，circPRKCI表达与E2F7的mRNA水平呈正相关（R2 11 = 0.49，P <0.01，图5B）。然后，使用miRNA-545和miR-589 mimic设计了拯救实验（图5C）。miR-545和miR-589的表达部分逆转了circPRKCI对SPC-A1细胞中E2F7，p21和Cyclin D1的影响（图5D），能部分挽救由circPRKCI诱导的增殖促进作用，并且两种miRNA mimic的组合显示出更强的拯救效果（图5E）。为了进一步确定circPRKCI是否发挥依赖于miR-545/589结合位点的增殖促进作用，分别构建了具有miR-545（circPRK1C Mut1），miR-589（circPRK1C Mut1）和两种突变位点结合的circPRKCI载体（circPRKCI Mut1 + 2），结果显示单独的miR-545或miR-589结合位点的突变可以部分逆转由circPRK1诱导的细胞增殖，而miR-545和miR-589结合位点的双突变完全消除circPRKCI诱导的细胞增殖（图5F）。这些结果证明circPRKCI通过circPRKCI-miR-545/589-E2F7促进LAC细胞增殖。

图六

9、circPRKCI促进体内LAC肿瘤发生并作为潜在的治疗靶点

为了研究circPRKCI在体内的生物学功能，作者在裸鼠中建立了异种移植肿瘤模型。将用si-circPRKCI或对照siRNA转染的SPC-A1细胞皮下注射到裸鼠中。两种细胞衍生的肿瘤相比，用si-circPRKCI转染的细胞比对照组具有更小的尺寸和更低的重量（图6A）。免疫组化（IHC）显示，与对照组相比，从si-circPRKCI组收集的肿瘤组织具有更少的E2F7和Cyclin D1阳性细胞，但是更多的p21阳性细胞（图6B）。此外，众所周知，与源自细胞系的异种移植物相比，患者衍生的肿瘤异种移植物（PDTX）保持了更好的细胞分化能力，形态学和原始患者肿瘤的体系结构，因此PDTX被认为是癌症的移植模型研究。然后，作者从女性LAC患者开发了PDTX模型，并通过肿瘤内注射胆固醇结合的si-circPRKCI和对照siRNA（每周4次和2次）评估了circPRKCI的治疗潜力。因此，si-circPRKCI的治疗显着抑制体内PDTX的生长（图6C），表明circPRKCI可以作为LAC有希望的治疗靶标。由于EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）已被广泛用于EGFR突变的LAC患者，为了确定circPRKCI是否影响EGFR-TKI的治疗效果，作者在HCC827细胞中进行了增殖测定（该细胞具有EGFR E746-A750缺失，对EGFR-TKI敏感）。如预期的那样，单独的EGFR-TKI（吉非替尼）或单独的沉默circPRKCI在HCC827细胞中显示出细胞毒性作用。吉非替尼与沉默circPRKCI联用显示，与单独使用吉非替尼或si-circPRKCI相比，抑制效果显着更强（图6D），这表明联合抑制EGFR和circPRKCI可能具有潜在的协同抑制作用。